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PCR（基因擴增實(shí)驗室）檢測微量感染因子時(shí)，操作人員容易因為污染而導致各種問(wèn)題。SLD中檢實(shí)驗室技術(shù)根據多年行業(yè)經(jīng)驗，給出的建議是：進(jìn)行PCR操作時(shí)，操作人員一定要嚴格遵守一些操作規程，最大程度地降低可能出現的PCR污染事故的發(fā)生。?


一、PCR實(shí)驗室劃分操作區：?
    目前，對于普通PCR，業(yè)內還無(wú)法做到單人單管和實(shí)現完全封閉管理操作，但無(wú)論是否能夠達到單人單管，均要求實(shí)驗操作在三個(gè)不同的物理區域內進(jìn)行，PCR的前處理和后處理一定要設計在不同的隔離區內進(jìn)行：?
1、標本處理區，包括：擴增摸板制備;??
2、PCR擴增區，包括：反應液的配制和PCR基因擴增;??
3、產(chǎn)物分析區，包括：凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆制備。??
各工作區要具有一定的隔離，操作器材要專(zhuān)用，而且要有一定方向性，如，?標本制備→?PCR擴增→?產(chǎn)物分析→④產(chǎn)物處理。切記：產(chǎn)物分析區的產(chǎn)物及器材嚴禁拿到前后兩個(gè)工作區，避免交叉污染。?


二、PCR實(shí)驗室試劑分裝要求：?
    PCR擴增所需要的試劑均應在裝有紫外燈的負壓工作臺或超凈工作臺進(jìn)行配制和分裝，所有的吸頭和加樣器都需固定放于其中，吸頭不能用來(lái)吸取擴增后的DNA和其它來(lái)源DNA：??
1、PCR用水應為高壓的雙蒸水;?
2、引物和d-NTP用高壓的雙蒸水在無(wú)PCR擴增產(chǎn)物區配制;?
3、引物和d-NTP應分裝儲存，分裝時(shí)應標明分裝時(shí)間，以備發(fā)生污染時(shí)及時(shí)查找原因和追溯污染源頭;??

三、PCR擴增重要標準??
1、PCR實(shí)驗靈敏度?
    PCR實(shí)驗靈敏度：是指PCR擴增反應能夠檢測到目的基因的最小值。?研究結果表明，影響PCR擴增效率的因素，有模板的完整性、反應溫度、復雜程度、引物純度及其與模板結合效率、DNA聚合酶的熱穩定性與擴增性能、反應緩沖液的離子組成(主要指：陽(yáng)離子)、反應優(yōu)化劑等，這些因素都顯著(zhù)影響
PCR實(shí)驗檢測靈敏度。在最佳擴增條件下，常規PCR反應能夠檢測到pg(10～12g)數量級目的基因。對于一個(gè)特定的目的基因，模板與引物通常都是已經(jīng)限定好的因素。因此，選擇什么樣的PCR反應體系(包括DNA聚合酶與反應緩沖液等)就是研究者提高PCR實(shí)驗靈敏度的關(guān)鍵因素了。??
2、PCR實(shí)驗特異性???
    PCR實(shí)驗特異性：是指在PCR擴增過(guò)程中，專(zhuān)一性擴增目的片段而非其他
片段的性能。?
    在PCR實(shí)驗本身的靈敏度很高，且實(shí)驗條件未充分優(yōu)化的情況下，通常會(huì )在目的片段出現同時(shí)伴隨有其它雜帶，即發(fā)生非特異性擴增現象。模板、引物性質(zhì)及質(zhì)量、反應條件控制等均會(huì )影響PCR擴增特異性。近年來(lái)的研究結果表明，緩沖液品質(zhì)(如反應優(yōu)化劑、離子種類(lèi)與組成等)對保證PCR特異性擴增起著(zhù)重要作用。??
3、PCR靈敏性和特異性關(guān)聯(lián)?
    PCR實(shí)驗靈敏度與特異性是一對此長(cháng)彼消特性，這也決定我們實(shí)驗體系調節實(shí)際上就是需要找到適合實(shí)驗靈敏度與特異性的平衡點(diǎn)。由于PCR體系中的成分眾多，使得組合較多，篩選工作也就相對繁雜。?四、PCR實(shí)驗操作注意事項：?
    盡管PCR擴增序列的殘留污染大部分是假陽(yáng)性反應導致的，但樣品間的交叉污染也是常見(jiàn)原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴增反應時(shí)要謹慎對待，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節都應謹慎操作，一般需做到以下幾點(diǎn)：?
1、戴一次性手套，若不小心濺上反應液，應立即更換手套;?
2、避免反應液飛濺，若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面;?
3、使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長(cháng)時(shí)間暴露于空氣中，避免空氣中氣溶膠的污染;?
4、操作多份樣品時(shí)，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后再分裝，這樣既可以減少操作次數，避免污染，又可以增加反應的精確度；?
5、最后加入反應模板，加入后蓋緊反應管;?
6、操作時(shí)設立空白對照和陰陽(yáng)性對照，既可驗證PCR反應的可靠性，又可
以協(xié)助判斷擴增系統的可信性;?
7、由于實(shí)際操作時(shí)加樣器很容易受產(chǎn)物氣溶膠或標本DNA的污染，所以操作者最好使用高壓處理過(guò)的或可替換的加樣器。假如沒(méi)有這種特殊的加樣器，至少在PCR操作過(guò)程中加樣器應該專(zhuān)用，嚴禁交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)相鄰區域使用;?
8、重復實(shí)驗，驗證結果，慎下結論。?

五、綜述：?
    由于PCR實(shí)驗操作非常專(zhuān)業(yè)，在設計PCR基因擴增實(shí)驗室時(shí)設計師也要充分考慮上述技術(shù)要求，避免PCR實(shí)驗室在后續使用時(shí)出現返工、返修問(wèn)題。